1.范围
本标准规定了婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定方法。
本标准适用于婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定。
2.规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。
第一法 微生物法
3.原理
利用植物乳杆菌( Lactobacillus plantarun)ATCC 8014对泛酸的特异性,在含有泛酸样品中生长产生的酸度和形成的光密度来测定泛酸的含量。
4.试剂和材料
除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯试剂,水为GB/T 6682规定的二级水。
4.1 0.9%生理盐水:9.0g氯化钠溶解于1000mL水中,分装于具塞试管中,每管10mL,121℃灭菌15min。每周准备一次。
4.2 泛酸钙标准品。
4.3 乙酸溶液(0.2mol/L):吸取12mL冰乙酸用水稀释至1000mL。
4.4 甲苯(C7H8)。
4.5 乙酸钠溶液(0.2mol/L):溶解16.4g无水乙酸钠于水中,稀释至1000mnL。
4.6 菌株:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarun)ATCC 8014。
4.7 培养基
4.7.1 乳酸杆菌琼脂培养基:光解胨15g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,番茄汁100mL,磷酸-氢钾2g,聚山梨糖单油酸酯1g,琼脂10g,加蒸馏水至1000mnL,调pH至6.8±0.2(20℃～25℃)。
4.7.2 乳酸杆菌肉汤培养基:光解胨15g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,番茄汁100m,磷酸二氢钾2g,聚山梨糖单油酸酯1g,加蒸馏水至1000mL,调pH至6.8±0.2(20℃～25℃)。
4.7.3 泛酸测定用培养基:葡萄糖40g,乙酸钠20g,无维生素酸水解酪蛋白10g,磷酸氢二钾1g,磷酸二氢钾1g,L-胱氨酸0.4g,L-色氨酸0.1g,硫酸镁0.4g,氯化钠20mg,硫酸亚铁20mg,硫酸锰20mg,硫酸腺嘌呤20mg,盐酸鸟嘌呤20mg,尿嘧啶20mg,胡萝卜素400μg,盐酸硫胺素200μg,生物素0.8μg,p-氨基苯甲酸200μg,烟酸1mg,盐酸吡哆醇800μg,聚山梨糖单油酸酯0.1g,加蒸馏水至1000mL,调pH至6.7±0.1(20℃～25℃)。
4.8 Tris缓冲液:称取24.2g Trizma base于烧杯中,加200mL水溶解。
4.9 盐酸(0.1mol/L):吸取8.3mL盐酸,用水稀释至1000mnL。
4.10 标准溶液
4.10.1 泛酸标准贮备液(40μg/mL):精确称取45mg～55mg泛酸钙标准品(4.2),溶入500mL蒸馏水中,加10mL乙酸溶液(4.3),加100mL乙酸钠溶液(4.5),用水稀释至泛酸钙精确浓度为43.47μg/mL(即泛酸浓度为40μg/mL),加0.5mL甲苯(4.4)贮于2℃～4℃冰箱中,保存期为4个月。
4.10.2 泛酸中间贮备液(1μg/mL):取25mL标准贮备液(4.10.1),加入蒸馏水500mL,乙酸溶液10mL(4.3),乙酸钠溶液100mL(4.5),再用水稀释至1L。加0.5mL甲苯(4.4)贮于冰箱中(2℃～4℃),保存期为1个月。
4.10.3 泛酸标准工作液(10ng/mL,5ng/mL):吸两次5.0mL中间贮备液(4.10.2),分别用水定容至500mL和1000mL,临用前配制。
5.仪器和设备
5.1 分光光度仪。
5.2 pH计:精度为0.01。
5.3 涡旋振荡器。
5.4 天平:感量0.1mg。
5.5 生化培养箱:36℃±0.5℃。
5.6 离心机:转速≥2000转/分钟。
6.分析步骤
6.1 测试菌液的制备
6.1.1 把植物乳杆菌( Lactobacillus plantarun)ATCC 8014冻干菌粉转入乳酸杆菌肉汤培养基(4.7.2)试管中,36℃±1℃培养24h。再转接至乳酸杄菌琼脂培养基(4.7.1)试管中,36℃±1℃培养24h
培养好的乳酸杆菌琼脂培养基(4.7.1)试管的培养物作为贮备菌种。
6.1.2 从贮备菌种培养基上分别转接到三个乳酸杄菌琼脂培养基(4.7.1)试管中,放入培养箱中36℃±1℃培养24h。每月转接一次,作为月接种管贮于冰箱中。每月定期从月接种管中重新接种3个转接管保存新菌株。
6.1.3 从月接种的培养管中的一支再接种一支乳酸杄菌琼脂培养基(4.7.1)试管,36℃±1℃培养24h,作为日接种管每日测定用。
6.1.4 从日接种管中接种一管乳酸杆菌肉汤培养基(4.7.2),36℃±1℃培养24h。在无菌条件下离心该培养液10min(2000转/分钟),弃去上清液。用10mL生理盐水(4.1)振荡洗涤菌体,离心10min(2000转/分钟),弃去上清液,用10mL生理盐水(4.1)振荡清洗。如前离心操作,弃去上清液。再加10mL生理盐水(41),混匀。吸1mL该菌悬液于10mL生理盐水(4.1)中,混匀制成测试菌液。
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